丁公藤的作用详解

　　　　以毛果芸香碱(pilocarpine)为代表的拟胆碱药是一类历史悠久、效力较强的抗青光眼药物,均为毒蕈碱受体(muscarinic receptor,M受体)的激动剂,其降眼压作用机制尚未完全明了。多数学者认为是直接兴奋睫状肌的纵行肌，牵引巩膜嵴，开大小梁网间隙，增加房水外流（用于开角型青光眼）［1，2］；直接兴奋虹膜括约肌，引起缩瞳，减少虹膜在房角的堆积，开放房角，恢复房水的正常循环（用于闭角型青光眼）。1987年，Bonner等［3］应用分子克隆技术，证实了M受体的5个亚型，分别命名为M1～M5受体。M受体兴奋后，可通过一系列信号转导(signal transduction)机制发挥作用。信号转导机制主要有3个方面：（1）激活磷酰脂肌醇(phosphatidylinostal，PI)；（2）抑制腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)或激活鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase, GC)；（3）离子通道(ionic channal)的变化，但至今各M受体亚型的确切信号转导机制尚未阐明。1992年Gabelt和Kaufman［4］的研究证实毛果芸香碱对猴眼的房水外流、调节痉挛及缩瞳作用均通过M3受体介导。

　　丁公藤碱(erycibele alkaloid)是我国特有的应用于临床的抗青光眼中草药，具有与毛果芸香碱相同作用的M受体激动剂［5-7］。但丁公藤碱作用于哪个M受体亚型？又通过哪些信号转导机制发挥其降眼压作用？为探讨丁公藤碱的分子药理学机制，我们进行了以下研究。

　　材料和方法

　　一、缩瞳、降眼压实验

　　1.瞳孔的测定:将兔固定于箱内,于恒定强度的光线下，用瞳孔尺测定瞳孔直径。

　　2.眼压测定:将兔固定于箱内，安静半小时,用0.4%丁氧普鲁卡因进行眼球表面麻醉,用气动眼压计(美国Digilab model 30R-T pneuma-tonometer)测量眼压,重复测量3次,取其平均值,记录眼压曲线。

　　3.将兔的1只眼滴入平衡盐溶液100μl作为空白对照，另1只眼滴入某一浓度丁公藤碱100μl，分别于滴眼后30min、1、2、3、4、5及6h测定双眼瞳孔大小和眼压变化,选取瞳孔缩小和眼压下降最大值进行统计学处理,每一浓度丁公藤碱滴用10只兔眼，共5个浓度50只兔眼。2周后,对照眼仍滴用平衡盐溶液作为空白对照；实验眼先给予4%pirenezepine(M1受体拮抗剂),30min后,再滴入不同浓度的丁公藤碱,方法同上；观察家兔双眼6h内的瞳孔大小及眼压变化。另取100只兔，将4% pirenzepine改为2% gallamine(M2受体拮抗剂)或0.4%4-单磷酸脱氧腺苷(deoxyadenosine monophosphate,DAMP)(M3受体拮抗剂)重复上述实验,即可获得各亚型拮抗剂拮抗丁公藤碱对眼压和瞳孔的药效变化。

　　4.相应累积效应为纵坐标绘图,可获得S形曲线,按改良Lineweaver-Burk公式使之直线化,求得解离常数(KD)和最大效应(Emax)。将所得数据通过计算机软件,求得丁公藤碱的pD2值(激动剂解离常数的负对数,表示激动剂对M受体的亲和力)和各亚型拮抗剂的pA2值(竞争性拮抗剂解离常数的负对数,表示拮抗剂对M受体的亲和力)。

　　二、离体虹膜实验

　　细心分离出完整虹膜,按虹膜内等腰三角形三顶端各穿一线,底边二线连于通气钩上,另一端连于拉力换能器上,负荷500mg，平衡1h后,制作不同浓度丁公藤碱虹膜累积量效收缩曲线，然后冲洗虹膜3次，分别加入M1受体亚型拮抗剂pirenzepine,M2受体亚型拮抗剂gallamine和M3受体亚型拮抗剂4-DAMP,其分子质量浓度均为10mol/L，共0.2ml，平衡30min后,再重复不同浓度的丁公藤碱,记录收缩曲线,以各累积剂量的对数为横坐标,相应累积效应为纵坐标绘图,得S形曲线,按改良Lineweaver-Burk公式使之直线化,求得KD和Emax。

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